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纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量即可测定纤维素酶的活力。

纤维素酶（CelluLase）是一种复合酶，包括外切葡聚糖苷酶（C1酶）、内切葡聚糖苷酶（CX）酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分，可协同作用将纤维素降解为葡萄糖。纤维素酶主要来自于真菌、细菌和动物体内，其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶能催化纤维素降解，还能通过提高植物细胞壁的通透性，来提供植物细胞内含物的提取率，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。

• 实验时可用1.5mL离心管进行；
  
• 煮沸时离心管盖上要扎一小孔防止煮沸时盖子弹开。

• 组织样本：
  取组织称重，按重量(g)：试剂一(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积的试剂一，冰水浴匀浆，4000转/分钟常温离心10min，取匀浆上清一部分待测，另一部分沸水浴5min（使酶失活）后取出冷却，制成煮沸的匀浆上清；
  
• 细菌或培养细胞：
  
  • 称重法：取样时可以先取离心管用万分之一天平称重，再收集细菌或细胞到离心管内，1000转/分钟离心5min后弃上清，再次称重，减去空离心管重量，再按2(mg)∶1000(μL)或1(mg)∶1000(μL)的比例加入提取液，超声破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s、间隔10s，重复30次），4000转/分钟4℃离心10min，取匀浆上清一部分待测，另一部分沸水浴5min后取出冷却，制成煮沸的匀浆上清；
    
  • 细胞个数法：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积为500～1000∶1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s、间隔10s，重复30次）；4000转/分钟常温离心10min，取匀浆上清一部分待测，另一部分沸水浴5min后取出冷却，制成煮沸的匀浆上清。

• 酶促反应：
  
  • 按下表加入各成分配制反应体系：
    

    成分	测定管	对照管
    匀浆上清(μL)	50	-
    煮沸的匀浆上清(μL)	-	50
    试剂一(μL)	50	50
    试剂二(μL)	200	200
    蒸馏水(μL)	50	50

  • 混匀，37℃孵育30min后，立即取出放入沸水浴中煮沸15min，取出流水冷却，4000转/分常温离心10min，制备糖化液上清。
• 显色反应：
  
  • 按下表加入各成分配制显色反应体系：
    

    成分	空白管	标准管	测定管	对照管
    糖化液上清(μL)	-	-	50	50
    蒸馏水(μL)	50	-	-	-
    2mg/mL葡萄糖标准液(μL)	-	50	-	-
    试剂三(μL)	150	150	150	150

  • 混匀，沸水浴反应15min，取出流水冷却。
    
  • 各反应管中加入1mL蒸馏水。
    
  • 混匀，波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管OD值。

• 按蛋白浓度计算：
  
  • 活力定义：每毫克组织蛋白中的纤维素酶每分钟催化纤维素水解产生1μg还原糖定义为一个酶活力单位。
    
  • 计算公式：
    

    CL活力 (U/mgprot)	＝	A测定﹣A对照	×C标准×V反总÷(V样×Cpr)÷T
    		A标准﹣A空白

• 按组织鲜重计算：
  
  • 活力定义：每克组织中的纤维素酶每分钟催化纤维素水解产生1μg还原糖定义为一个酶活力单位。
    
  • 计算公式：
    

    CL活力 (U/g组织)	＝	A测定﹣A对照	×C标准×V反总÷(	V样	×W)÷T
    		A标准﹣A空白		V提

• 按细胞密度计算：
  
  • 活力定义：每1万细菌或细胞中的纤维素酶每分钟催化纤维素水解产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
    
  • 计算公式：
    

    CL活力 (U/104细胞)	＝	A测定﹣A对照	×C标准×V反总÷(	V样	×m)÷T
    		A标准﹣A空白		V提

• 前处理：将2mg/mL葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成400μg/mL、800μg/mL、1200μg/mL、1600μg/mL、2000μg/mL几个梯度后，制作标准曲线。
  
• 操作表：
  

  成分	空白管	标准管
  蒸馏水(μL)	50
  不同浓度的葡萄糖标准品（μL）		50
  试剂三显色剂(μL)	150	150
  混匀，沸水浴反应15min，取出流水冷却
  蒸馏水(μL)	1000	1000
  混匀，波长550nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管OD值。

• 绘图如下：